检测食品中乳酸菌的侧流免疫层析法

  乳酸菌(LAB)会导致食品酸化并产生异味成分，Tatsuya Tominaga设计了一种侧流免疫层析法(LFIA)结合半导体pH传感器的方法快速检测乳酸菌。
  抗原抗体结合具有高特异性，一些抗体（Ab）将特定的细菌成分作为抗原，因此这些Ab可用于细菌检测。在涉及多种细菌属的情况下，使用单个Ab检测LAB非常困难，而以植物乳杆菌为免疫原获得的抗体能与所有LAB反应，以此抗体为基础进行LFIA。然而LFIA检测结果中pAb Lpl的光谱太宽，无法将阳性结果全部归于LAB，将LFIA法与半导体传感器结合，利用半导体传感器测量pH值，将LAB与其他阳性菌进行区分。LFIA检测步骤如下，用金属或乳胶胶体标记的抗体(Abs)结合样品溶液中的细菌，细菌-胶体复合物通过毛细管作用在LFIA试纸上迁移，并被另一个预固定的Ab捕获。复合物在该位置积累变成线条或斑点，用于细菌检测。
  该实验评估了使用LFIA结合半导体pH传感器进特异性检测LAB可行性。对食品悬浮液进行了LAB检测和pH检测，通过记录与比对检测结果以及两项测试均为阳性的培养时间，评估了此方案检测成功率以及新鲜食品和变质食品是否可以以此区分。此外，利用扩增子分析来确定LAB是否在变质食品中生长。从酵母中分离三弗朗西斯乳杆菌A1、A2、C1、植物乳杆菌B1和短乳杆菌B2。以F. sanfranciscensis A1和A2为免疫原制备多克隆抗体(pAb) Fsa，以植物乳杆菌B1和短乳杆菌B2为免疫原，分别制备pAb Lpl和pAb Lbr。
  乳杆菌属细菌的LFIA检测谱见表1。结果表明，Lpl-LFIA能够检测多种LAB，进一步显示了Lpl-LFIA的适用性。除乳酸菌属外培养收集到的细菌检测谱见表2。
 表 1乳杆菌属细菌的LFIA检测光谱
表 2LFIA对乳酸菌属以外菌株的检测光谱
  一共检测出12个属25个种32株的乳酸菌(表1,2)。除LAB外，还检出革兰氏阳性菌，包括芽孢杆菌和葡萄球菌。对收集到的菌株进行产酸能力测试(表3)。在该测试中，LAB的pH范围为pH 3.16至pH 4.34，革兰氏阳性菌的pH范围为pH 4.49至pH 5.66。说明LFIA阳性和pH < 4.40 (pH阳性)条件下，检测LAB能力受到了限制。
表 3不同菌株的产酸能力检测结果
  将购买的食品在≤7℃的冰箱中保存1 d，或从有效期起保存超过一周，制备食品悬浮液。将培养液中细菌洗涤后与葡萄糖溶液混合，将混合物涂于离子敏感场效应晶体管半导体pH传感器，进行产酸能力测试。构建用于LFIA的测试条后，将洗涤后的细菌细胞连续稀释进行LFIA检测。为了计算LAB的数量，将食物悬浮液加入MRS琼脂培养基中，表4列举培养基中形成的菌落，以cfu(菌落形成单位)表示。并从每种食物悬浮液中提取1ml DNA，进行PCR、测序和数据分析。
表4LFIA的敏感性及产酸能力试验。
  使用4株乳酸菌、3株芽孢杆菌和1株葡萄球菌进行敏感性试验(表4)。对于乳酸菌，至少存在4 - 5 log10 (cfu)细菌时，LFIA呈阳性，当至少存在6-7 log10 (cfu)细菌时，产酸能力试验呈阳性。芽孢杆菌和葡萄球菌LFIA≥5-6 log10 (cfu/test)呈阳性，未见pH阳性菌株。当样品中存在≥6-7 log10 (cfu) LAB时，检测结果为LFIA阳性和pH阳性。结果表明，LFIA比产酸比力试验更敏感。
  该实验分别记录了新鲜和变质食物的培养物LIFA阳性和pH阳性的所需时间(表5)，结果表明，LFIA与pH检测相结合可以检测食品的腐败程度。
  表 5食品样品LFIA及产酸能力试验结果  利用扩增子分析对28种LAB数量增加的食品进行了微生物群调查(表6)。
   表 6食物中的微生物群  
   从敏感性试验中发现，当样品溶液中LAB浓度> 6-7 log10 (cfu)时，LFIA和pH试验均呈阳性。新鲜食品不太可能被这种水平的LAB污染，因此我们对食物悬浮液进行多次培养，评估食物腐坏时是否出现LIFA阳性和pH阳性结果，验证是否可以区分新鲜和腐坏的食物。
  在这些食物中，无法确定三种(胡萝卜，卷心菜，火腿)是否变质。胡萝卜样品中并没有LAB污染。由于新鲜和变质样品显示阳性的培养时间相同，因此无法检测到白菜的变质状态。卷心菜含有萝卜硫素具有抗菌特性，抑制乳酸菌的生长。火腿没有检测到腐败的原因可能是因为培养时间太短。
  该研究成功建立了一套能在1h内检测出食品中乳酸菌的检测系统,以植物乳杆菌B1作为免疫原，获得了能够检测包括LAB在内的多种革兰氏阳性菌的Ab，利用这种Ab进行侧流免疫层析法能够检测大多数LAB。
原始出处：Tatsuya Tominaga. Rapid detection of lactic acid bacteria by lateral flow immunochromatographic assay. Journal of Microbiological Methods ,2023，209:16730.