多重LAMP和侧流核酸生物传感器用于铜绿假单胞菌及其毒素基因的快速可视化检测

         多重LAMP和侧流核酸生物传感器用于铜绿假单胞菌及其毒素基因的快速可视化检测
1.研究背景
  铜绿假单胞菌是一种常见的致病菌，它可以引起多种感染，包括肺部感染、尿路感染等。目前常用的检测方法需要使用复杂的实验设备和技术，不适合在临床和野外等条件下进行快速检测。因此，本研究旨在开发一种简单、快速、便携的检测方法，能够准确检测铜绿假单胞菌及其毒素基因的存在。研究采用了多重LAMP（环介导等温扩增）技术和侧流核酸生物传感器相结合的方法，通过放大目标基因并使用纳米颗粒进行可视化检测，实现了在点对点的环境下进行铜绿假单胞菌的快速检测。这种方法具有快速、简单、低成本的特点，有望在临床和野外等场景中得到广泛应用。

2.原理
2.1多重LAMP反应
  将设计好的引物加入反应混合液中，在65℃的水浴中进行40 min的等温扩增反应，然后在80℃下终止反应。
  使用3组引物分别分析了3种不同的毒素基因（ecfX、ExoS 和 ExoU），其中3组引物鉴定了所有3个靶标，而3重 LAMP 没有靶标特异性引物，但分别使用所有其他引物。从理论上讲，在任何3重 LAMP 中都不应观察到扩增子，而 LAMP 反应中没有靶标特异性引物。正如预期的那样，在存在ecfX模板的情况下，3重LAMP给出了阳性结果，但在2-plex LAMP中没有观察到阳性结果，在没有ecfX模板的情况下，所有2-plex LAMPs都给出了阳性结果，但在所有1-plex LAMPs中都没有观察到阳性结果（图A）。因此，共存引物在mLAMP检测中没有引起任何假阳性结果，表明可以使用LAMP同时鉴定多个靶标。
  所有的2重LAMP和3重LAMP产生与单重LAMP相同的阳性扩增子，其仅对ecfX具有特异性。常规LAMP的检测限为每次反应检测10个模板拷贝;因此，当多个引物共存时，mLAMP的灵敏度不会降低（图B）。

                                            
2.2多重LAMP与侧流核酸生物传感器耦合

                        
2.3侧流核酸生物传感器的优化


2.4 侧流核酸生物传感器的特异性

从左到右，通过mLAMP产生的样品分别为：ddH2O、其它细菌菌株DNA、ATCC 27853 DNA+其它细菌菌株DNA、PAO 1 DNA+其它细菌菌株DNA、PA 103 DNA、PA 99 DNA。这些结果表明LFNAB在生物样品中具有内在的结合选择性和特异性。
2.5侧流核酸生物传感器的敏感性

  样品中PA 99的浓度为：10 CFU/mL、20 CFU/mL、40 CFU/mL、80 CFU/mL、100 CFU/mL。在LFNAB测试系中观察到浓度低至20 CFU/mL的PA 99 DNA的红色条带。
2.6侧流核酸生物传感器的高再现性

  通过在PA 99 DNA(100 CFU/mL）存在下检测样品溶液6次，这些测试每隔一周进行一次，评估LFNAB的重现性，每次可以获得类似的响应。相应的光学响应的RSD值为1.7%，表明测量的重现性良好。
2.7侧流核酸生物传感器的稳定性

  稳定性是评价生物传感器的另一个重要指标。将LFNAB在室温下储存一个月后，它们的反应没有显著变化。对PA99 DNA的检测结果表明，该生物传感器具有良好的稳定性。
3.结论
  研究结果表明，多重LAMP可以同时识别多个目标基因，并且与传统PCR方法相比，多重LAMP具有更快的反应速度、更容易操作和更高的特异性。该传感器显示出高特异性，并且在50分钟内检测低至20 CFU/ mL的铜绿假单胞菌或其毒素基因。与传统的PCR和LAMP相比，目前的方法简单得多，无污染，避免了使用专门的仪器和高素质的人员的要求。LFNAB可用于快速检测水和临床标本，无需任何样品预处理或训练有素的技术人员。为了使系统真正便携的POCT应用，我们系统地优化了LFNAB的制备和检测条件。LFNAB和mLAMP的组合将为医院、战争前线、发展中国家和偏远地区的铜绿假单胞菌基因诊断提供快速、廉价、高灵敏度的系统。

文献来源： Chen Y , Cheng N , Xu Y ,et al.Point-of-care and visual detection of P. aeruginosa and its toxin genes by multiple LAMP and lateral flow nucleic acid biosensor[J].Biosensors and Bioelectronics, 2016, 81:317-323.